荧光寿命成像 (FLIM)
什么是荧光寿命成像 (FLIM)?
荧光寿命成像（FLIM）用于绘制样品内荧光寿命的空间分布。传统成像中，每个像素对应光强；而在 FLIM 中，每个像素对应分子的荧光寿命。荧光寿命是指荧光分子（荧光团）从受激后停留在激发态，到返回基态并发射光子所经历的特征时间。
图 1 给出了 FLIM 的基本原理。光子入射分子后，可使电子从基态跃迁至激发态。在激发电子态内，电子通过振动弛豫降至较低的振动子能级，并在与周围环境（如其他分子或溶剂）的相互作用中耗散能量。随后，电子衰减回基态，并在一段特征延迟后发射光子；这段延迟即荧光寿命。
荧光寿命不仅取决于具体的荧光团，也会受到其所处环境影响。分子间相互作用会改变弛豫过程，进而改变荧光团寿命。因此，FLIM 可用于区分分子相互作用的不同阶段。此外，荧光寿命与分子浓度无关，这使 FLIM 特别适合研究分子尺度的生化相互作用——此类样品中的荧光团浓度往往不均一或随时间变化。
在多种 FLIM 方法中，时间相关单光子计数（TCSPC）可实现最高的时间分辨率和光子探测效率。Swabian Instruments - 施瓦本仪器® Time Tagger 专为这类高精度测量而设计，可连接光电倍增管（PMT）、单光子雪崩探测器（SPAD）和超导纳米线单光子探测器（SNSPD）等多种光子探测器。Time Tagger 能够测量激发脉冲与荧光衰减光子之间的时间差，从而精确求得样品的荧光寿命。
该技术既可进行单点测量，也可扫描整个样品。结合三维压电扫描或数字微镜器件（DMD）光束偏转等方法，即可获得完整的荧光寿命分布图像，全面呈现分子相互作用及其动态过程。
FLIM 可用于研究微观尺度上的多种生物、化学和物理过程，例如利用 FRET-FLIM 研究蛋白质间相互作用 1, 以及研究癌细胞微环境 2.
荧光寿命成像（FLIM）实验所需的时间测量电子学
图 2 展示了一套典型的 FLIM 测量系统。本例采用扫描共聚焦显微镜，这是 FLIM 实验中广泛使用的实现方式。光源通常为皮秒脉冲激光器，发出的光经显微镜直接照射样品。光学系统将光斑缩小，从而实现亚微米级定位精度和高空间分辨率。样品产生的荧光光子随后进入单光子探测器。通过三维压电位移台精确移动样品，可将采集事件与对应样品位置关联。激光触发、光子探测以及与像素位置相关的时间标记等全部信号，均由 Time Tagger 实时同步采集。
FLIM 的时间分辨率通常受激光脉冲宽度，以及探测器和时间数字转换器（TDC）电子学抖动的限制。随着超快激光器的发展，激光脉冲宽度已不再是主要限制因素，探测器和读出电子学的抖动则往往成为关键参数。典型 SPAD 的抖动约为数十至数百皮秒，而新一代 SNSPD 的时间分辨率已低于 10 ps。要充分发挥探测器性能，时间测量电子学的抖动应低于探测器本身。Swabian Instruments - 施瓦本仪器® Time Tagger 可精确测定光子到达时间，时间抖动低至 1.5 ps。
FLIM 应用需要重点关注以下硬件参数：
- 时间抖动： 时间测量电子学的抖动越低，测量的分辨率和精度越高。选型时应同时考虑探测器抖动，并尽量确保电子学抖动低于探测器抖动。
- 多通道配置： 要同步采集光源、探测器和压电位移台的信息，时间测量电子学必须能够对多路信号进行精确采集与相关分析。当实验需要将探测器信号与每个像素对应的时间窗口关联时，这一点尤为关键；空间分辨率越高，所需处理的复杂度也越高。
- 数据传输速率： 更高的传输速率可在更短时间窗口内采集更多光子事件，提高测量的统计显著性。若传输能力不足，系统可能发生溢出和数据丢失；除非在数据传入计算机前采用过滤机制控制采集量。有效的数据过滤应综合各通道（激光器、探测器、控制器、触发信号等）的计数率，判断哪些事件需要传输。
施瓦本仪器® Time Tagger：高精度荧光寿命成像（FLIM）的先进解决方案
灵活直观的软件引擎
FLIM 需要同步采集多种信号并进行高精度相关分析。 Swabian Instruments – 施瓦本仪器®软件易于使用和部署，并支持实时测量。皮秒级延迟补偿、虚拟通道等功能可显著缩短系统搭建时间并简化校准。虚拟通道能够同时追踪多个光子探测事件，尤其适合强度相关分析或符合计数实验。例如，可利用压电扫描器产生的时间标记定义精确时间门，将光子准确映射到对应像素。有关这些功能的配置方法及更多进阶应用， 请参阅 Time Tagger 用户手册 。
自动化实验流程：充分利用 Python、MATLAB、LabVIEW、C#、C/C++ 原生库
借助 Swabian Instruments – 施瓦本仪器® 提供的编程库，您只需使用熟悉的编程语言编写少量代码，即可搭建完整的 FLIM 实验并实现强大的实验室自动化。
从容应对新一代探测器
Swabian Instruments – 施瓦本仪器®Time Tagger 系列 采用灵活的输入级，可无缝连接 PMT、SPAD、SNSPD 等常见 FLIM 探测器。出色的时间分辨率也为未来更低抖动探测器的应用预留了性能空间。
多通道 FLIM 与自定义成像模式
凭借高数据速率和丰富通道数，Swabian Instruments - 施瓦本仪器® Time Tagger 可支持多色探测通道的高性能 FLIM 实验，也便于开发新型成像模式。加入自定义触发信号后，即可快速构建适合自身研究的成像方案。
Time‐Resolved Fluorescence Microscopy and Spectroscopy with ISS Microscopy
Time-Correlated Single-Photon Counting (TCSPC) with Single Quantum EOS SNSPD System
Brandon Ginkemeyer, Harvard
I really like the Swabian Instrument’s usability and reliability. A senior student in my neighboring group said that the Time Tagger is his favorite instrument.
查看更多内容Dr. Ted S. Santana, NPL
My experience with the Swabian Time Tagger has been excellent. It is a truly plug-and-play device with intuitive and user-friendly software.
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Gadella, T. W., & Jovin, T. M., „Oligomerization of epidermal growth factor receptors on A431 cells studied by time-resolved fluorescence imaging microscopy." Journal of Cell Biology, 129(6), 1543-1558 (1995). ↩︎
Lakowicz, J. R., et al., „Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH.", Proceedings of the National Academy of Sciences, 89(4), 1271-1275 (1992). ↩︎